O conjunto de técnicas conhecido como engenharia genética ou tecnologia
do DNA recombinante permite, entre outras coisas, transplantar genes de uma
espécie para outra e criar, assim, uma molécula de DNA diferente dos originais,
que não existia na natureza. Essa molécula, formada pela combinação de duas
moléculas diferentes de DNA, é chamada DNA
recombinante.
A grande vantagem dessa técnica é a rapidez e a precisão da
produção de uma substancia ou característica desejada. Antes, dependíamos da
seleção de mutações, ocorridas ao acaso; dos resultados de cruzamentos
artificiais; ou da extração de substancias normalmente produzidas por algum
organismo. Esses procedimentos são, em geral, demorados e a característica u
substancia obtida nem sempre é, exatamente, a desejada.
Recorte do DNA: Enzimas de restrição
Os vírus do tipo bacteriófago atacam bactérias,
reproduzem-se no interior delas e as destroem no fim do ciclo. Algumas
bactérias se defendem contra esse ataque produzindo enzimas especiais, endonucleases de restrição (do grego endon = interno), também chamadas enzimas de restrição. Essas enzimas
cortam o DNA do vírus em pontos específicos e impedem sua reprodução. A enzima EcoRI, por exemplo, produzida pela
bactéria Escherichia coli, foi a
primeira a ser descoberta. O nome dela vem das iniciais de Escherichia coli, mais R de Restrição
e o I (um) indica que ela foi a primeira
enzima a ser descoberta. A EcoRI
reconhece sequencias de bases GAATTC e corta as duas cadeias de uma molécula de
DNA entre o G e o A. Como essa sequencia se repete algumas vezes ao longo do
DNA viral, este é cortado em vários fragmentos. Outros organismos também
apresentam essa sequencia repetidas vezes em seu genoma. Dessa forma, EcoRI pode ser usada como uma “tesoura
molecular” que corta o DNA dos seres vivos em partes menores.
A)  |
B)
A) Esquema da ação de enzimas de restrição. O corte feito pela EcoRI (detalhe na figura B) será feito em sequências do tipo GAATTC, clivando entre G e A e gerando “pontas soltas” ou sequências palindrômicas (Obs: Palíndromos são palavras ou frases que podem ser lidas da esquerda para a direita ou da direita para a esquerda ex: AMORA e AROMA, ou no nosso caso, AATT e TTAA).
Clonagem do DNA e construção do DNA recombinante
Para formar um DNA recombinante, usamos enzimas de
restrição que cortam pontos específicos no DNA de um organismo. O trecho
extraído é então inserido na fita de DNA de um organismo diferente. Ao se
multiplicar, esse organismo passa a fazer várias cópias idênticas do DNA
estranho. Observe o exemplo abaixo:
Esquema simplificado da produção de insulina humana por bactérias. Neste exemplo podemos ver a tecnologia do DNA recombinante aplicada a produção de insulina, hormônio secretado pelo pâncreas e que controla a utilização de glicose pela célula. Os indivíduos portadores de diabetes tipo I não produzem esse hormônio e, por isso, apresentam deficiência na utilização de glicose, o que traz sérias consequências para a saúde. Antes da engenharia genética, a insulina utilizada era de origem suína e bovina. Mas o uso de insulina animal implicava um tempo prolongado de produção e purificação do hormônio, pois eram necessárias toneladas de pâncreas de porco e bois para garantir a produção comercial dessa substância. Além disso, como a insulina animal não é exatamente igual à humana, ela provoca reações alérgicas em alguns pacientes.
As bactérias Possuem, além do DNA principal, um pequeno DNA
circular, chamado Plasmídeo (representado em vermelho), no qual estão, com
frequência, genes que dão a elas resistência a antibióticos. No processo para
formar um DNA recombinante, é comum utilizarmos o plasmídeo como um vetor
(transportador) de genes de interesse (representado em azul). Esse plasmídeo
tem apenas uma cópia da sequencia de reconhecimento da enzima de e restrição
(em verde). Assim, quando se usa uma enzima de restrição, ele não se fragmenta
por completo, apenas abre o anel do DNA onde está a sequência de
reconhecimento.
Com o anel de DNA aberto, é possível usar uma outra enzima
para juntar os pedaços de DNA de diferentes origens. A enzima que promove essa
ligação dos fragmentos de DNA é chamada de DNA-ligase, nossa “Cola molecular”.
Os fragmentos de DNA estranho podem ser originários de uma
célula humana, por exemplo, e ser responsável por transcrever determinada
proteína. Ele deve ser obtido com a mesma enzima de restrição que foi usada
para abrir o plasmídeo. Isso garante que as extremidades do fragmento de DNA
estranho sejam complementares às do plasmídeo cortado.
Depois que recebe o fragmento de DNA de outro organismo, o
plasmídeo torna-se um DNA recombinante, isto é, uma molécula formada pela união
de duas ou mais moléculas de DNA não encontradas juntas na natureza. O DNA
recombinante é então introduzido na bactéria, que passa a produzir, por
exemplo, uma proteína humana (ex: a insulina).
Quando a bactéria se reproduz, o DNA recombinante também se
replica e passa para as novas bactérias. Esse processo de produção de cópias
idênticas de DNA é chamado de clonagem de DNA, clonagem molecular ou clonagem
gênica. O resultado é a formação de uma colônia de bactérias capazes de
sintetizar, por exemplo, proteínas humanas. Como é relativamente simples manter
a bactéria se reproduzindo em laboratório, é possível produzir bancos de cepas
bacterianas contendo diversos tipos de sequencias de DNA de interesse clonados
em seus plasmídeos (uma biblioteca genética), como também, utiliza-las para a
produção de substâncias em escala comercial, alimentando a indústria, agricultura
e saúde.
Além da insulina, são produzidos outros hormônios, como o hormônio do
crescimento, a eritropoetina (que estimula a produção de glóbulos vermelhos) e
diversos tipos de vacinas, como a contra hepatite B. Os fatores obtidos por
engenharia genética estão livres da contaminação por vírus que podem estar
presentes no plasma humano, tornando essa tecnologia de extrema importância
para o tratamento de doenças nos dias atuais e com grande potencial para a
geração de novas alternativas/estratégias de tratamento de doenças. Abaixo vemos um exemplo da utilização da tecnologia do DNA recombinante para a geração de vacinas de DNA contra a tuberculose:
Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose, se esconde dentro
das células humanas e não é atingido pela ação dos anticorpos. Estimulando os
linfócitos T CD8 (uma das principais células de defesa de nosso organismo),
capazes de destruir especificamente as células infectadas pelos bacilos,
poderia ser desenvolvida uma forma de combater esta doença. Estes macrófagos
são estimulados somente quando os antígenos (proteínas dos bacilos) são produzidos
dentro de células, como acontece nas infecções virais. Sendo assim, um pedaço
de DNA (o código genético contendo a mensagem para a célula fazer o antígeno) e
inserido em um retrovírus fabricado em laboratório pelas técnicas de engenharia
genética. As células (macrófagos) infectadas com esse retrovírus recombinante
sintetizam os antígenos, estimulando os linfócitos T CD4 e T CD8 e induzindo a proteção
contra infecção por M. tuberculosis. A vacina de DNA, ou vacina gênica, é
baseada num pedaço do código genético do agente causador da doença. Quando aplicado
por meio de injeção intramuscular, esse DNA cria condições para a produção da
proteína antigênica pelas próprias células do indivíduo vacinado.
Para mais detalhes sobre a tecnologia do DNA recombinante, assista o vídeo "Biologia - Tecnologia do DNA Recombinante" do Portal Genius.
Referências:
- Linhares S. ; Gewandsznajder F. e Pacca H. Biologia Hoje. Editora Ática, 3ª Edição, Vol. 3 2017.
- Amabis & Martho. Fundamentos da Biologia Moderna . Editora Moderna, 4ª Edição, Vol. único 2006.
- http://www.comciencia.br/dossies-1-72/reportagens/tuberc/tuberc3.htm
- https://www.neb.com/products/r3101-ecori-hf
- https://www.youtube.com/watch?reload=9&v=XR7ZonN3vuQ
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